超多重 qPCR 新突破，閱爾基因創新技術在 Nucleic Acids Research 重磅發表
體外分子診斷技術常見于感染、腫瘤、遺傳病等需要明確病因的場景。其中熒光定量PCR（qPCR）因低成本、短耗時、裝機量大的特點非常適合快速轉化和臨床推廣，然而大部分qPCR儀只能提供4～6個檢測通道，與質譜、NGS等相比單次反應覆蓋的靶標范圍有所欠缺。超多重qPCR方法的技術革新彌補了這方面的不足，從而大為豐富qPCR的應用場景。以病原檢測為例，超多重聯檢既能滿足患者擴大排查范圍的需要，也可以為初檢陰性或經驗性治療無效的患者提供及時、全面的復測。
在多重qPCR方面，閱爾基因進行了大量探索工作，比如基于多色編碼組合的 Color-Mix策略、可用于RNA病毒分型的caPCR系統等等。近日，閱爾基因聯合復旦大學附屬中山醫院、同濟大學附屬肺科醫院，在經典的國際權威期刊《Nucleic Acids Research》（IF=16.6）發表了CCMA（Color Cycle Multiplex Amplification）超多重擴增技術1，利用同一靶標多個擴增子之間可控的Ct延遲設計多色編碼組合，單管qPCR反應即可鑒定21種常見病原體。理論上，僅需4個熒光通道可實現136重檢測。針對全血、痰液、肺泡灌洗液等復雜樣本的臨床驗證結果顯示，CCMA的靈敏度和特異性分別為89%和100%，有潛力作為臨床快速篩查病原感染的新型診斷工具。
超多重qPCR技術有諸多實現思路，但需要解決的核心問題是一致的。首先，有限的熒光通道數量與數倍甚至數十倍的通量需求相悖，如何提高判讀條件的維度十分關鍵。其次，體系中過多的引物探針種類可能帶來不穩定擴增現象，比如非特異性擴增、引物二聚體、不均一的擴增效率等等。接下來，我們從這兩方面來看該領域現有方案的設計思路以及CCMA的創新之處。
信號解耦
從qPCR儀讀取到的擴增曲線、溶解曲線、終點熒光值等信息，需要進行轉換和計算并對應到唯一的檢測結果。主流技術大致可分為以下三類：
第一類技術利用微流控等工程手段將qPCR反應分配到不同腔室或模塊以增加多重性，也是最為直接的實現方式，代表性產品包括生物梅里埃的FirmArray 、凱杰的QiaStat-Dx以及賽沛的GeneXpert。這類方法的優點在于將樣本前處理和后續數據分析集成到一套POCT設備中，然而設備耗材往往價格昂貴，并且出于有限的樣本濃度以及制造成本考慮，重數通常控制在10-20之間。
第二類技術使用不同熒光編碼組合來區分多個靶標，最大通量與熒光通道呈指數增長關系。比如一臺4通道儀器可以做到單管15重（2?-1），閱爾基因開發的Color-Mix2技術、以及部分數字PCR平臺均支持這種設計。單純的多色編碼難以應對多靶標共存的情況，因此ddPCR需要精確控制探針濃度（熒光強度）以增加判定維度3。Park等人提出的LiNC PCR技術則完全依靠熒光強度進行區分，這是通過在多重連接探針兩端設計數量不等的熒光探針結合位點來實現的?。更多的探針結合位賦予了LiNC PCR更強的多重能力，但也降低了PCR效率，并且系統性靈敏度受限于初始的連接反應效率。
第三類技術依賴于高分辨率溶解曲線（HRM），并且能夠與不同熒光標記的探針形成數量可觀的判讀組合，檢測通量在20～60重左右。市場上已經有一些基于HRM的診斷試劑產品。這類方法流程方便，但實驗操作條件要求較高，如單個堿基突變時熔解溫度差異很小，此時對qPCR儀的溫度分辨率和溫度均一性就有很高的要求。同時該方法對變異的容忍度較低，探針結合區域的錯配堿基可能導致溶解曲線大幅偏移?。此外，隨著探針數目增加，較高的背景信號也限制了其最低檢測下限。這些問題的存在限制了HRM的臨床推廣。
另外還有一些免擴增方法，比如基于編碼微球的流式熒光技術，基于磁共振的T2MR技術，它們在通量上具有顯著優勢，但另一方面也高度依賴于特殊儀器和耗材。
圖1 CCM的設計原理
CCMA技術是首個僅需借助常規qPCR儀即可實現超指數級多重且可定量檢測的技術。其核心原理是：為每個靶標設計多個擴增子，在不同熒光通道的擴增曲線之間引入可編程的Ct值延遲，進而根據熒光出現順序識別不同靶標（圖 1）。比如2個熒光通道（G和R）最多可以鑒別4個靶標。熒光通道數（F）和可控Ct延遲數（T）決定了CCMA的多重性：
可控的Ct延遲是CCMA工作的基礎，這一特性是通過抑制探針置換擴增（BDA）原理實現的。Blocker抑制能力越強，熒光信號起峰的時間就會越晚。通過熱動力學參數可以精確調節擴增曲線的相對關系，并且無Blocker擴增子的Ct值可以作為定量結果（圖 2）。
圖2 CCM的實現方法
針對樣本中可能存在多個靶標的問題，雙管、雙擴增曲線（T=2）的CCMA策略可以區分任意單一或成對靶標。以血流感染（BSI）為例，其中約 89.3% 的病例為單一感染源，復合感染以兩種致病菌的情況居多，雙管CCMA檢測可以覆蓋約98.6%的病例。
多重擴增
超多重qPCR的另一個難點來自于引物二聚體和非特異性擴增的干擾。為了彌補單條引物濃度下降帶來的擴增效率降低，多重擴增體系通常會增加循環數和退火延伸時間，這也加劇了二聚體甚至多聚體的形成。
目前主流的抑制二聚體的思路包括1）設計具有特殊結構的引物；2）使用UDG酶、Cas9或基于片段大小的純化方法去除二聚體；3）利用算法優化引物設計。前兩種策略一定程度增加了試劑成本或產物損失。第三種策略則對引物設計有著更嚴格的要求，然而主流算法中很少專門針對引物二聚體進行深度優化。閱爾基因聯合上海肺科醫院開發的二聚體似然估計的模擬退火設計（SADDLE）算法，能夠進行多重PCR引物的全自動化設計和迭代優化，在大型panel中實現了超低的引物二聚體水平?。驗證實驗顯示，384-plex panel（768條引物）的引物二聚體比例僅為1%。
圖3 SADDLE算法的基本流程
借助SADDLE算法設計21聯病原體檢測試劑盒（63-plex panel）并對PCR產物進行NGS分析，證明了CCMA體系極低的脫靶率和引物二聚體水平。即使在高濃度人源gDNA干擾的情況下，目標擴增子的reads 占比也明顯高于脫靶擴增 reads。進一步，將病原體檢測panel與168-plex非病原微生物panel混合后，CCMA的檢測結果依然不受影響，并且沒有出現非特異性擴增（假陽性）的情況。這證明了CCMA具備模塊化設計的能力，SADDLE算法的正交優化能力降低了不同體系設計中引物互作的風險。
圖4 基于CCM檢測21種病原體的qPCR panel設計
起始量在5～1800拷貝之間時，63-plex panel檢測各個靶標DNA的相鄰擴增曲線之間的Ct 延遲（ΔCt）中位值分別為 2.30 和 3.65，并且始終不低于0.9，證明CCMA良好的擴增穩定性。理論上，BDA探針可以實現小于3且可復現的ΔCt，從而允許設置更多編碼組合，比如兩通道體系將Ct延遲數（T）從2增加到3時可以將編碼組合從4種提高到6種。另一方面，反應速率可調性也為平衡各個擴增子之間的PCR效率提供了較為直接的途徑。
最低檢測限（LoD）方面，在30 拷貝及以上水平，CCMA 成功檢出所有21個病原體的DNA模擬樣本，并且其中12個病原體（如李斯特菌）的LoD低至5拷貝。
定量準確性方面，以100拷貝起始量對21種病原體進行三次重復定量，中位標準差分別為0.18、0.25 和 0.31。回歸分析顯示標準曲線的決定系數（R2）在0.994 至 0.999 之間。此外，不同試劑批次、操作人員和時間點的重復實驗證明了CCMA的定量可重復性，首位Ct值的標準差為0.25，相當于不到20%的起始量變化。
總之，CCMA多重熒光定量體系的主要特點可以總結如下：
·以BDA原理為基礎的可編程熒光編碼系統，實現了超指數級多重PCR
·SADDLE算法降低了引物二聚體的產生，保證了擴增體系的穩定性和特異性
·使用常規qPCR儀進行檢測，引物探針的類型和修飾與常規Taqman 熒光定量法一致
·LoD和定量能力與常規qPCR一致，可檢測低至5～30拷貝的靶標分子
·最低僅需200uL全血即可一次排查21種常見病原菌
·可以容忍模板序列上一定程度的單堿基多態性
·耐受模板中高濃度的宿主核酸
除了成本和速度上的優勢以外，超多重性將為qPCR檢測方案拓展更廣闊的應用前景。特別地，超多重qPCR的可定量性對于臨床端的價值不容忽視，尤其在病原檢測方面，可以幫助醫生判斷感染程度以及感染源的主次關系。CCMA技術在呼吸道疾病、血流感染等領域已經初步展現出臨床應用價值，集成化且模塊化的設計流程以及靈活的體系優化方式為開發更多高可用性的超多重qPCR病原檢測產品提供了平臺。
參考文獻
1. Chen, W. et al. Advancing quantitative PCR with color cycle multiplex amplification. Nucleic Acids Res (2024) doi:https://doi.org/10.1093/nar/gkae683.
2. Xie, N. G. et al. High-Throughput Variant Detection Using a Color-Mixing Strategy. J Mol Diagn 24, 878–892 (2022).
3. Santos-Barriopedro, I., Sylvain Ursuegui, Etienne Fradet & Rémi Dangla. Robust higher-order multiplexing in digital PCR by color-combination. bioRxiv (2023) doi:https://doi.org/10.1101/2023.05.10.540190.
4. Huang, Q. et al. Highly multiplex PCR assays by coupling the 5′-flap endonuclease activity of Taq DNA polymerase and molecular beacon reporters. Proc Natl Acad Sci 119, (2022).
5. Joon Soo Park, Pisanic, T., Zhang, Y. & Wang, T.-H. Ligation-Enabled Fluorescence-Coding PCR for High-Dimensional Fluorescence-Based Nucleic Acid Detection. Anal Chem 93, 2351–2358 (2021).
6. Xie, N. G. et al. Designing highly multiplex PCR primer sets with Simulated Annealing Design using Dimer Likelihood Estimation (SADDLE). Nat Commun 13, (2022).
關于閱爾基因
閱爾基因是一家技術創新驅動的全球基因組學公司，擁有多項革命性的分子檢測技術，可將所有NGS平臺的測序成本降低98%以上，并將qPCR、Sanger和納米孔測序的靈敏度提高100倍以上。
閱爾基因在美國休斯頓、中國上海、中國蘇州和中國啟東均設有分部，旗下擁有CAP/CLIA雙認證醫檢所以及符合國際標準的GMP生產車間。閱爾基因的愿景是創造負擔得起的、及時的和準確的基因分析工具，與諸多合作伙伴一起實現精準醫療并改善患者預后。
